El Microscopio
Hay dos grandes problemas que dificultan la observación de las microestruturas biológicas: las pequeñas dimensiones de las células y de sus organelas y su transparencia a la luz visible, lo cual tiene como consecuencia inmediata la falta de contraste entre las diferentes estructuras y entre estas y el propio medio que las rodea. Para superar el primer problema, se construyeron y se perfeccionaron instrumentos capaces de aumentar significativamente las imágenes, revelando los pormenores de las estructuras (microscopios); para resolver el segundo problema, se desarrollaron técnicas, fundamentalmente del tipo de las tinciones, que permitían aumentar el contraste entre las diferentes estructuras y entre ellas y su entorno, haciéndolas claramente visibles y diferenciables. (Nuno G. Dias)
Microscopio, del griego: "mikro" = pequeño y "scopeõ" = mirar (para mirar cosas pequeñas)
Un microscopio es un instrumento óptico compuesto de varias lentes que sirve para observar objetos muy pequeños. En el microscopio electrónico, los rayos luminosos del microscopio convencional son reemplazados por un haz de electrones (el aumento puede alcanzar en este caso hasta 100 veces el del microscopio convencional).
Aunque la existencia de criaturas demasiado pequeñas para ser vistas con el ojo había sido sospechada desde tiempo atrás, su descubrimiento real está ligado a la invención del microscopio.
La primera persona que vio los microorganismos con algún detalle fue el constructor de microscopios aficionado Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723); este holandés usó microscopios simples construidos por él mismo (se dedicaba a pulir lentes para fabricar sus microscopios que, como mucho, alcanzarían unos 300 aumentos). En 1677 escribe una carta a la Philosophical Transactions of the Royal Society of London en la que comunicaba sus recientes observaciones con los microscopios de su fabricación.
Desde ese momento, el microscopio óptico se ha transformado en uno de los medios más importantes para el diagnóstico de las infecciones. Aun hoy, a pesar del énfasis en los métodos rápidos de diagnóstico, muchos de los cuales requieren instrumentos complicados o reactivos inmunológicos, la simple observación visual de la muestra clínica obtenida de un paciente es la forma más rápida y específica de apoyar el diagnóstico clínico realizado por el médico.
Muchos agentes infecciosos pueden ser identificados en forma fiable con sólo unas pocas coloraciones y un microscopio básico. La coloración de Gram aún es el método individual mas eficiente y económico para el diagnóstico rápido y precoz de una infección bacteriana.
Por definición, toda la información y los conocimientos relacionados con el microscopio son piedra angular en el estudio de la microbiología. (imagen superior: El primer microscopio de Leeuwenhoek)
El microscopio óptico compuesto
El microscopio compuesto, que se ha hecho de uso general a partir de mediados del siglo XIX y que fue de importancia crucial para la evolución de la microbiología como ciencia, es todavía, con ciertas variaciones, el principal apoyo de la investigación microbiológica rutinaria.
Este tipo de microscopio está formado básicamente por una parte mecánica y una parte óptica y es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este último, llamado microscopio simple, se usa principalmente en el formato de lupa.
Los elementos mecánicos básicos son el pie (7), que es el soporte del microscopio, la columna (3), en la que se apoyan las restantes piezas, el tubo, que es el elemento de unión entre el ocular y el revólver (pieza giratoria que soporta los objetivos), la platina, sobre la que se apoya la preparación a observar, y los tornillos Micrométrico y Macrométrico que se utilizan para enfocar la preparación (el primero es de pequeño recorrido, para movimientos de pequeña amplitud, y el segundo de largo recorrido, para movimientos de gran amplitud.
En cuanto a la parte óptica, un microscopio compuesto tiene dos lentes o sistemas de lentes: el objetivo (4), situado cerca del objeto que se observa, proyecta una imagen ampliada del objeto observado en dirección al ocular (1), que está colocado cerca del ojo y actúa, a modo de lupa, ampliando la imagen que produce el objetivo, y el condensador (5), cuya misión es concentrar la luz sobre la preparación y permitir manipular su intensidad.
La ampliación total aportada por el conjunto objetivo-ocular es igual al producto de multiplicar la capacidad de aumento del objetivo por la del ocular; así: la mayor parte de los microscopios usados en microbiología tienen oculares de diez aumentos (abreviadamente, x10) y objetivos de aumentos diversos, habitualmente x10 (aumento total, x100), x40 (total, x400), y x90 ó x100 (objetivos de inmersión en aceite; x900 ó x1000 total).
Las lentes de menor aumento se utilizan para rastrear la preparación buscando objetos de interés, el objetivo de 40 aumentos permite la observación detallada de los microorganismos grandes tales como algas, protozoos y hongos, y los objetivos de 90 ó 100 aumentos se emplean para ver las bacterias y los pequeños microorganismos eucariotas.
Además del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder resolutivo. Este es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos; y por tanto, cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor será la definición con que podremos observar un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeñas estructuras.
El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda utilizada y de una propiedad óptica de la lente conocida como apertura numérica. Como la longitud de onda habitualmente está fijada, la resolución de un objeto es función de la apertura numérica; cuanto mayor sea la apertura, el objeto resuelto será más pequeño. Hay una correspondencia aproximada entre el aumento de un objetivo y su apertura numérica, de tal modo que las lentes con mayores aumentos habitualmente tendrán mayores aperturas numéricas. (El valor de la apertura está marcado al lado de la lente)
El sistema de iluminación de un microscopio es también de considerable importancia, especialmente cuando se utilizan grandes aumentos. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación para que la imagen se traslade de forma adecuada al objetivo y llegue con la mayor calidad posible al ojo del observador a través del ocular. En los microscopios antiguos, la fuente de luz era externa, y se utilizaba un espejo, situado en el propio microscopio, para reflejar esa luz externa hacia la preparación y los objetivos. Actualmente se utiliza un sistema de lentes, incorporado al propio microscopio, llamado condensador (5). Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de la luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso. El condensador tiene también un diafragma iris, que controla el diámetro del círculo de luz que pasa por el sistema.
Lo que se busca con este diafragma iris no es controlar la intensidad de la luz que alcanza el objeto, sino asegurar que la luz que pasa por el sistema condensador ocupe justamente el objetivo. Si el diafragma iris es demasiado grande, parte de la luz pasará no sólo al objetivo sino también alrededor de él, y no se utilizará. Si la luz es demasiado brillante, no deberá reducirse alterando la posición del condensador o del diafragma iris sino usando filtros de neutralización, o disminuyendo el voltaje de la lámpara. Nunca se insistirá lo suficiente en que el ajuste apropiado de la luz es crucial para la buena microscopía, especialmente a los mayores aumentos.
Los tornillos macro/micrométrico (2) están engarzados con la platina que soporta las muestras por medio de un mecanismo de cremallera y se utilizan para subir y bajar dicha platina (acercarla o alejarla del objetivo) con el fin de enfocar la imagen que se forma en el ocular. El tornillo macrométrico maneja un engranaje de paso largo, diseñado para efectuar movimientos de gran amplitud y largo recorrido, mientras el tornillo micrométrico controla un engranaje de paso corto, especial para movimientos de pequeña amplitud y pequeño recorrido y se utiliza para el enfoque fino de la imagen.
Microscopio electrónico
Para estudiar la estructura interna de los procariotas es esencial el uso del microscopio electrónico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Cuando los electrones pasan a través de la preparación algunos son difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los electrones. La longitud de onda de la radiación de los electrones es mucho más pequeña que la de la luz visible y, como el poder resolutivo de un microscopio es inversamente proporcional a la longitud de onda utilizada, la resolución obtenida con el microscopio electrónico es mucho mayor que la conseguida con el microscopio óptico.
Mientras que con el microscopio óptico ordinario o el de contraste de fases las estructuras más pequeñas que pueden observarse tienen unos 0,2 µm, con el microscopio electrónico pueden verse fácilmente objetos de 0,001 µm. Con el microscopio electrónico es posible ver muchas sustancias incluso de tamaño molecular. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados: si se está interesado en ver estructuras internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente.
Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio electrónico se necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las células primero deben ser fijadas y deshidratadas, realizándose habitualmente esto último transfiriendo las células a un disolvente orgánico. Después de la deshidratación, la muestra es incluida en plástico y en este plástico se cortan secciones finas utilizando un ultramicrótomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola célula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas después individualmente con el microscopio electrónico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se tratan con colorantes especiales de la microscopia electrónica, tales como ácido ósmico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales están compuestos por átomos de elevado peso molecular y, por ello, dispersan bien los electrones. Las estructuras celulares teñidas con uno de esos materiales presentan un contraste muy aumentado y; por tanto, se ven mejor.
Otro modo de conseguir contraste con el microscopio electrónico es la tinción negativa. Se aplica el mismo principio que en la tinción negativa del microscopio óptico. Se utiliza una sustancia que no penetra la estructura pero que dispersa los electrones. Una de las tinciones negativas más comúnmente utilizadas en la microscopia electrónica se realiza con ácido fosfovolfrámico (fosfotúngstico). Para examinar las superficies celulares pueden prepararse réplicas de carbono evaporando sobre la superficie de las células una fina capa de carbono que se adapta a los contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida resulta suficientemente delgada para poder observarse directamente al microscopio electrónico.
Otra técnica de la microscopía electrónica recientemente desarrollada es la de criocorrosión que evita la formación de artefactos al eliminar la fijación química y la inclusión. La muestra que va a examinarse es congelada sin tratamiento químico, y el bloque congelado se corta con una cuchilla de diamante, de tal modo que se eliminan porciones de las superficies de las células. Se hacen y se examinan entonces réplicas en carbono de esas superficies, pudiéndose observar estructuras superficiales o internas de las células. La mayoría de las estructuras celulares vistas en secciones ultrafinas de preparaciones fijadas químicamente se ven también en material congelado, lo que sugiere que esas estructuras no son artefactos.
OTROS MICROSCOPIOS.
El microscopio de contraste de fases:
Hace posible visualizar fácilmente pequeñas células incluso sin teñir. Las células tienen un índice de refracción distinto del medio que las rodea, y esta diferencia puede utilizarse para crear una imagen de mucho mayor contraste que el que puede obtenerse con el microscopio óptico normal. La microscopia de contraste de fases hace posible observar células en estado vivo más fácilmente, ayudándonos así a evitar la creación de condiciones artificiales tales como las introducidas por la tinción (aparición de artefactos que interfieren con la correcta visión y alteración de las estructuras naturales de las célula). En muchos laboratorios de bacteriología, el microscopio de contraste de fases ha reemplazado prácticamente el microscopio óptico común como instrumento de investigación.
Esta técnica se basa en el hecho de que las diferentes estructuras celulares introducen pequeñas variaciones de fase en las radiaciones, retrasándolas ligeramente, siendo estos retrasos diferentes según el tipo de estructura. Con este microscopio, el bajo contraste existente se refuerza por medio de un sistema óptico especial, que transforma las diferencias de fase, que no son captadas por el ojo humano, en diferencias de amplitud (intensidad luminosa), que sí son detectables.
El microscopio de campo oscuro:
La microscopía de campo oscuro hace posible la observación en estado vivo de partículas y células que de otra manera estarían por debajo de los límites de resolución del microscopio óptico, aunque resulten visibles pocos detalles estructurales. La microscopia de campo oscuro ha sido ampliamente usada en el estudio de pequeñas células móviles tales como Treponema pallidum, la espiroqueta causante de la sífilis, que es invisible con la microscopía óptica ordinaria.
El microscopio de fluorescencia:
Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energía) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta). A medida que las moléculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energía en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiación excitante. Esta propiedad se denomina fluorescencia. Se han desarrollado métodos microscópicos modernos que aprovechan la mayor detección que posibilita este sistema.
Este tipo de microscopios lleva una fuente luminosa que emite radiaciones ultra-violeta, en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparación de de la misma forma en que lo hace un microscopio óptico común. Las lentes suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-violeta. A continuación del objetivo lleva unos filtros que retienen la radiación ultra-violeta, que es peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiación visible, que no es peligrosa.
Hoy día se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual la luz es emitida desde arriba del preparado (epifluorescencia). Un filtro deja pasar luz de la longitud de onda deseada para excitar al fluorocromo y un filtro barrera en el objetivo protege al ojo del observador de la radiación fluorescente. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, según el color del colorante usad.
Bibliografía:
http://www.danival.org/notasmicro/_madre_micro.html
http://www.microbiologia.com.ar/microscopia/index.html
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